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Unité de recherche : UMR  CNRS 5290 / IRD 224 / UM   "MIVEGEC"

Equipe BioGEPPE

« Biologie, Génétique et Pathologie des Pathogènes Eucaryotes »

L'équipe développe des approches de biologie moléculaire et cellulaire et de génomique fonctionnelle chez plusieurs protozoaires parasites, essentiellement les Trypanosomatidés Leishmania (responsable des leishmanioses) et Trypanosoma brucei (agent de la maladie du sommeil) et, plus récemment, Plasmodium falciparum (agent du paludisme) avec l'arrivée d'une équipe ATIPE/Avenir CNRS/Inserm dirigée par JJ Lopez-Rubio (équipe "Plasmodium Genome Plasticity"). Elle est organisée en deux groupes, l'équipe de Patrick Bastien proprement dite et l'équipe ATIPE/Avenir de Jose Juan Lopez-Rubio.

La disponibilité des séquences complètes de ces génomes, alliée aux développements technologiques les plus récents, permettent d’explorer les grandes fonctions chromosomiques chez ces micro-organismes eucaryotes considérés comme 'divergents' sur le plan de l'évolution : ségrégation, réplication, transcription, recombinaison... L’objectif général de cette recherche est de comprendre l'intrication de ces différents processus au cours du cycle cellulaire et leur importance dans le cycle de vie du parasite, ainsi que dans sa virulence ou dans son adaptation au milieu ou aux drogues anti-parasitaires.

Les données de biologie moléculaire chez les Trypanosomatidés posent de nombreux problèmes d’interprétation : en particulier, les mécanismes de régulation de la transcription semblent profondément originaux avec l’absence de région promotrice pour les gènes transcrits par la polymérase II (à l’exception du gène du mini-exon), une organisation de type polycistronique regroupant des dizaines de gènes sans rapport fonctionnel entre eux en grands segments unidirectionnels, et une production non négligeable d’ARN anti-sens. Ces données éloignent Leishmania et les Trypanosomatidés de tout système biologique connu et en font des modèles d'étude particulièrement originaux. Tout comme la régulation de l’expression des gènes, les grandes fonctions chromosomiques que sont la réplication et la ségrégation pourraient être tout aussi surprenantes, comme l’indique la ploïdie étonnamment variable désignée sous le terme d'aneuploïdie mosaïque, mise en évidence dans notre laboratoire chez Leishmania, ou encore l'absence de centromères caractérisés.

L'équipe "Trypanosomatidés" s'intéresse actuellement à deux grandes fonctions : ségrégation et réplication des chromosomes.

Concernant la réplication, le travail engagé vise à cartographier les origines de réplication au cours du cycle cellulaire. Les approches expérimentales reposent sur les technologies de gels 2D, peignage moléculaire et ChIP-seq. Concernant la ségrégation chromosomique, un certain nombre de protéines associées aux kinétochores ont récemment été identifiées, confirmant la nature non-conventionnelle de ses structures chez les Trypanosomatidés. D'autres protéines sont impliquées, comme certaines nucléoporines, identifiées ou en cours d'identification dans le laboratoire. Ces processus sont étudiés en utilisant, entre autres, les technologies de ChIP-seq et d'interactome.

L’équipe a également réalisé la preuve de concept de l’efficacité du système CRISPR-Cas9 chez Leishmania major en délétant le locus PFR2 (Sollelis et al. Cell Microbiol. 2015).

Ces travaux sont réalisés en collaboration entre autres avec l'équipe d'Artur Scherf à l'Institut Pasteur de Paris et de Derrick Robinson (UMR-CNRS 5234, Univ. Bordeaux 2), dans le cadre du LabEx national ParaFrap, et d’Etienne Schwob à l’Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier ("IGMM", CNRS 5535 – UM).

L'équipe ATIP/Avenir  "Plasmodium Genome Plasticity" s'intéresse à deux axes principaux.

1) Le premier concerne le rôle des mécanismes de réparation de l'ADN dans la diversité génomique de Plasmodium falciparum. De l'émergence des résistances médicamenteuses aux adaptations saisonnières du virus de la grippe, la capacité des pathogènes à évoluer empêche le développement d'interventions efficaces à long terme contre de nombreuses maladies. Dans le cas de l'agent du paludisme Plasmodium falciparum, la diversité génétique et la plasticité évolutive constitue des obstacles majeurs à l'élimination de la maladie. Les régions sub-télomériques, qui portent des gènes codant les molécules variables de surface impliquées dans la cytoadhérence et l'évasion immunitaire, sont les régions chromosomiques les plus diverses et recombinogènes chez ce parasite. La pression médicamenteuse peut apparemment provoquer l'apparition de loci résistants dans n'importe quelle autre région chromosomique. Une part importante de cette variabilité vient de variations de nombre de copies (Copy Number Variations ou CNVs) qui inclut conversions géniques, délétions, insertions, et duplications/amplifications. Les CNVs implique des changements dans la structure des chromosomes et la réparation de cassures double brin de l'ADN (double strand breaks ou DSBs). Étant donné que P. falciparum doit faire face aux mêmes sources de DSBs que les autres eucaryotes, la réparation de ces cassures constitue un aspect important mais mal connu de la biologie du parasite, particulièrement dans les régions sub-télomériques où la plupart des gènes de virulence sont retrouvés.

Les récentes évolutions technologiques rendent possible l'étude des DSBs et de leurs voies de réparation chez P. falciparum. L'équipe développe une technique de réparation de l'ADN basé sur une endonucléase pour directement mesurer les compétitions et collaborations entre plusieurs voies et analyser comment le contexte de réparation et les propriétés spécifiques de l'ADN cassé peuvent affecter ce processus. Elle réalise également une approche génétique à haut débit qui devrait révéler des facteurs nouveaux impliqués dans la réparation de l'ADN et leur rôle dans la production de diversité génomique chez ce parasite. Ces connaissances seront importantes pour évaluer le succès des développements futurs de moyens de contrôle vaccinaux ou médicamenteux.

2) L'équipe s'intéresse également à la mise au point d'outils innovants pour l'analyse du génome de P. falciparum basé sur une "dead Cas9". Au cours de ces dernières années, le système CRISPR-Cas9 s'est imposé comme une révolution dans la manipulation des génomes chez plusieurs types cellulaires et organismes (Jinek et al. 2012). L'équipe a récemment fait la démonstration que ce système est parfaitement fonctionnel chez P. falciparum (Ghorbal et al. 2014). Une modification supplémentaire de Cas9 a permis de nouvelles applications du système CRISPR-Cas9. L'inactivation de l'activité nucléase de Cas9 par mutagenèse (appelée "dead Cas9" ou dCas9) permet de garder sa fonction de ciblage guidé par l'ARN ainsi que ses capacités de liaison à l'ADN (Gilbert et al. 2013). Nous voulons donc adapter dCas9 à P. falciparum pour isoler les régions chromatiniennes spécifiques. De plus la fusion de dCas9 avec différents domaines de régulation a permis de produire une activation transcriptionnelle ou une suppression de l'expression génique, spécifique, robuste, et même inductible, chez l'homme et chez la levure (Mali et al. 2013). Une fusion dCas9 pourrait aussi être utilisée pour réaliser une modulation épigénétique ciblée. Cet outil permettrait, pour la première fois, une dissection fonctionnelle des différents événements déclenchants retrouvés dans des études d'associations en épigénétique. Une autre application de ce système est d'étudier l'organisation nucléaire et la dynamique des chromosomes (Chen et al. 2013).>

Sur un plan davantage appliqué, l'hébergement de l'équipe par le CHRU de Montpellier favorise des études "translationnelles" axées sur le diagnostic moléculaire des leishmanioses et de la toxoplamose. A ce titre, certains membres de l'équipe font partie du Centre National de Référence des Leishmanioses et/ou du Pôle "Biologie moléculaire" du Centre National de Référence de la Toxoplamose, dont le rôle est d'améliorer et d'harmoniser ce diagnostic au niveau national.  D'autres études sont développées sur le diagnostic et la pathogénie des mycoses invasives chez les patients immuno-déprimés.

 

Membres de l'équipe :
(titulaires et CDD-longs)

 

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